M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑
本制品使用通過基因重組技術(shù)克隆表達的點突變型RNase H活性缺失的 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶。野生型的M-MuLV 包含的RNase H活性能夠催化降解DNA/RNA雜合體中的RNA，因此在cDNA第一條鏈的合成反應中可能會降解RNA/DNA雜合體中的模板RNA。M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑
Script III M-MuLV Reverse Transcriptase
M-MuLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑
目錄號：71117
產(chǎn)品內(nèi)容
Components | 71117-10000 | 71117-50000 |
M-MuLV (200U/ μl) | 10000 U | 50000 U |
5x RT Buffer | 250 μl | 5x 500 μl |
保存條件：-20℃保存，有效期 12 個月
產(chǎn)品簡介
本制品使用通過基因重組技術(shù)克隆表達的點突變型RNase H活性缺失的 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶。野生型的M-MuLV 包含的RNase H活性能夠催化降解DNA/RNA雜合體中的RNA，因此在cDNA第一條鏈的合成反應中可能會降解RNA/DNA雜合體中的模板RNA。本酶M-MuLV(RNase Hˉ)的RNase H活性缺失，與M-MuLV 相比，具有更強的延伸能力和穩(wěn)定性，可用于較長的cDNA合成以及高比例的全長cDNA文庫的構(gòu)建等。
適用范圍
第一鏈cDNA合成?？捎糜诘涂截惢虻臋z測。
產(chǎn)品特點
合成cDNA片段長度最高可達12 kb。
引物的選擇：
1. 如果RNA模板來源于真核生物，shou選Oligo (dT)，與真核生物mRNA的 3’PolyA尾配對，可獲得最高產(chǎn)量的全長cDNA。
2. 如果對一些物種，不能確定mRNA是否有polyA尾的情況下，shou選Oligo (dT)，不成功再嘗試基因特異性引物(GSP)和Random primer為引物。
3. 基因特異性引物(GSP)的特異性較高。但有些情況下，用于PCR反應的GSP無法有效引導第一鏈cDNA合成，可改用Oligo (dT)或Random primer重新進行逆轉(zhuǎn)錄。
4. Random primer特異性zui低，所有RNA，包括mRNA，rRNA，tRNA均可以作為Random primer的模板。當目標區(qū)域具有復雜二級結(jié)構(gòu)或GC含量較高，或者模板為原核生物來源，使用Oligo (dT)或基因特異性引物(GSP)無法有效引導cDNA合成時，可使用Random primer為引物。
5. 如果合成cDNA下游用于qPCR，可將Oligo (dT)與Random primer混合使用（各加1μl /20μl反應體系），可使mRNA的各個區(qū)域cDNA合成效率相同，有助于提高qPCR結(jié)果的真實性和重復性。
第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應體系為例)
1.反應體系的配制
操作前，請將各組分輕彈混勻，點甩離心收集至管底，置冰上備用。
使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制：
Components | Volume |
Total RNA | 50 ng - 5 μg |
Oligo(dT)18 (0.5 μg /μl) or Random primer (N6) (0.1 μg/μl) or GSP (Gene Specific Primer , 2 pmol/μl) or | 1 μl |
1 μl | |
1 μl | |
5x RT Buffer | 4 μl |
RNase Inhibitor (40 units/μl) | 0.5 μl |
M-MuLV (200U/μl) | 1 μl |
RNase free H2O | To 20 μl |
2．輕柔吸打混勻，點甩離心，置 PCR 儀進行逆轉(zhuǎn)錄反應。
如用Oligo(dT)18或基因特異性引物(GSP)，產(chǎn)物用于PCR：42℃孵育30 min；
產(chǎn)物用于qPCR：42℃孵育15 min。
如用 Random Primer,25℃孵育10 min 后，產(chǎn)物用于 PCR，42℃孵育30 min；
25℃孵育 10 min 后，產(chǎn)物用于 qPCR，42℃孵育 15 min。
注意：如果模板具有復雜二級結(jié)構(gòu)或高 GC 區(qū)域，可以先只加 RNA 模板、引物和 RNase free H2O，混勻，65℃變性 5 min，冰上冷卻，點甩離心后加入其它成分，并將 42℃孵育溫度提升至 50°C，有助于提高產(chǎn)量。
3． 85°C加熱 5 sec，失活RTase和dsDNase，終止反應。
逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于PCR或qPCR反應，或保存于-20°C，并在半年內(nèi)使用；長期存放建議分裝后在-70°C保存，cDNA應避免反復凍融。
PCR
建議取2 - 4 μl的cDNA產(chǎn)物原液作為PCR模板。
1. 常規(guī)擴增：71019-2x Taq PCR MasterMix (30sec/kb)
71800-2x Lightning Taq PCR MasterMix (10sec/kb)
2. 高保真擴增：71812-2x FastHiFi PCR MasterMix (≤3kb片段)
71814-2×LongHiFi PCR MasterMix (≤10kb片段)
qPCR
建議取1~2μl cDNA產(chǎn)物原液作為20μl qPCR反應體系的模板。如果基因表
達量較高，請根據(jù)實際情況適當稀釋cDNA模板后使用。
相關產(chǎn)品：
71519 2x SYBR Green qPCR Mix (同TB Green Premix Ex Taq)
71600 2x Universal SYBR Green qPCR Mix (適用于所有qPCR儀)
91011 RNAzol Reagent（Trizol）
91013 通用型總RNA快速提取試劑盒（動物、植物、細菌、真菌、酵母）
91218 動物組織/細胞/昆蟲總RNA提取試劑盒 (同RNeasy Plus Mini Kit)
91318 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（RNeasy Plant Mini Kit的升級版)
91451 高效動物組織/細胞總RNA提取試劑盒 (動物組織、細胞)
91452 高效植物總RNA提取試劑盒（根、莖、葉、花）
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